Бэзил с Бейкер-Стрит — главный герой мультфильма, знаменитый мышиный сыщик. Его образ основан на вымышленном сыщике Шерлоке Холмсе. На протяжении развития всей сюжетной линии его основные задачи заключаются в поимке профессора Рэтигана, спасении отца Оливии, Хирама Флавершема, а также в предотвращении убийства мышиной королевы Виктории.
Доктор Дэвид К. Доусон — мышь-хирург, ранее служил в шестьдесят шестом королевском полку в Афганистане. Основан на докторе Джоне Х. Ватсоне из историй о Шерлоке Холмсе. Доусона восхищают методы раскрытия преступлений, созданные Бэзилом и активно им же практикуемые. В конце концов, он становится лучшим другом, помощником и личным биографом гениального детектива (в фильме аниматоры смоделировали характер Доусона лишь после создания его облика и внешнего вида).
Оливия Флавершем — маленькая мышка шотландского происхождения, которая обращается к Бэзилу с просьбой разыскать её похищенного отца.
Хирам Флавершем — любящий отец Оливии. Лучший мастер по изготовлению заводных игрушек. В начале фильма его похищает Фиджет, чтобы Хирам создал механическую копию мышиной королевы Виктории, необходимую для воплощения коварных планов Рэтигана. Хирам пытается сопротивляться, пока Рэтиган не начнет шантажировать жизнью его дочери.
Профессор Рэтиган — самый главный злодей. Он — крыса, но требует, чтобы его называли мышью(в формальном варианте говорится, что он не любит своих сородичей). Злобный, коварный, исключительно изобретательный. Его образ основан на образе профессора Джеймса Мориарти из записок о Шерлоке Холмсе. Рэтиган стремится захватить контроль над британской мышиной монархией, для чего и заставляет похищенного Флавершема работать на себя. В конце фильма, после ожесточенного боя с Бэзилом, падает с Биг Бена вместе с ним. Этот эпизод создан по аналогии с одним из рассказов о Шерлоке Холмсе, имеющим название «Последнее дело».
Фиджет — летучая мышь. Сподручник Рэтигана. Делает всю грязную работу за своего босса. Фиджет — калека. Вместо одной ноги у него деревянный костыль, а левое крыло сломано. Тем не менее, он всё ещё способен кое-как летать. В конце фильма Рэтиган бросает Фиджета из летающей машины в Темзу. Установлено (хотя в книге, а не в кино), что он пережил падение (как именно, не объясняется). Вероятно, в фильме он тоже погибает.
Мышиная королева Виктория — мышиная королева Англии, чей трон и пытается занять Рэтиган. Она является пародией на королеву Викторию и по фильму её юбилей совпадает с юбилеем реальной Виктории (что можно понять по украшениям Букингемского дворца).
Госпожа Джадсон — экономка Бэзила. Она обожает его, но бывает очень раздражена, когда он плохо обращается с её лучшими подушками, стреляя по ним из пистолета. Её прототип — миссис Хадсон.
Тоби — выдрессированный Бэзилом бассет-хаунд, живёт этажом выше своего мышиного прототипа. Служит Бэзилу транспортным средством.
Фелиция — массивная толстая кошка с голубым бантиком, любимица Рэтигана. Он подзывает её звоном колокольчика для расправы над своими врагами и предателями. Обычно он даёт ей съедать тех, кто, по его словам, огорчает его. В конце фильма она, убегая от Тоби, сдуру забегает в собачий питомник, где её собаки разрывают в клочья.
Бартоломео — один из приспешников Рэтигана. В начале фильма, во время песни Рэтигана, порядком пьяный Бартоломео называет своего босса «крысой». В ярости Рэтиган вышвыривает его на улицу, сказав: «О, дорогой Бартоломео, как я боюсь, что твой обморок огорчит меня!» — и призывает Фелицию, и та съедает опьяневшего воришку. При этой ситуации он был ещё жив, так как слышалось его рыгание из Фелиции.